實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，就是因?yàn)槟愫鲆暳诉@一步
實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，就是因?yàn)槟愫鲆暳诉@一步
ELISA實(shí)驗(yàn)操作雖然很簡(jiǎn)單，
但有時(shí)你辛辛苦苦做出的結(jié)果并不理想！
大多時(shí)是因?yàn)楹鲆暳诉@一步？！··· ···
上重點(diǎn) ！
優(yōu)化ELISA的重點(diǎn)之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結(jié)合抗體所引起的背景信號(hào)，從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結(jié)合事件被保留，在*后一步產(chǎn)生信號(hào)。而不充分的洗滌會(huì)導(dǎo)致差異和高背景，從而帶來(lái)不理想的結(jié)果。
在做ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)，洗板有兩種方法：手工法洗板和洗板機(jī)洗板。二者沒(méi)有本質(zhì)的差別，只要操作合乎要求，均能得到正確、可靠的結(jié)果。
手工洗板人為因素比較大，實(shí)驗(yàn)人員必須經(jīng)驗(yàn)豐富，洗滌次數(shù)要足夠，沖擊力又不要太大，加入的洗液量以剛滿反應(yīng)孔為限，防止孔口內(nèi)有游離酶未能洗凈，同時(shí)防止孔與孔之間液體交叉。洗滌結(jié)束后扣干亦非常重要，否則易造成假陽(yáng)性。每次洗完板后，在吸水紙上輕輕拍干，拍板時(shí)要垂直，避免交叉感染。用力不能過(guò)猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離;吸水紙要一次性使用，應(yīng)使用不易脫落碎屑的吸水紙為宜。酶結(jié)合物不耐干燥，特別在較高的溫度下更易失活，所以拍干的反應(yīng)板應(yīng)盡量縮短在空氣中暴露的時(shí)間，時(shí)間越長(zhǎng)，吸光度值越低。
手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種方法：
1.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液；
2.用洗滌液過(guò)洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；
3.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1～2分鐘，間歇搖動(dòng)，浸泡時(shí)間不可隨意縮短；
4.吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng)徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；
5.重復(fù)操作步驟3和4，洗滌3～4次（或按說(shuō)明規(guī)定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長(zhǎng)浸泡時(shí)間。
微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。
洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%～0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。
流水沖洗法*初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來(lái)水。洗滌時(shí)附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動(dòng)淋洗，持續(xù)沖洗2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、快速。
已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時(shí)設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。
洗板機(jī)洗板人為因素少，速度快，條件恒定，但是使用洗板機(jī)洗板時(shí)應(yīng)注意以下三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。
主要的參數(shù)是洗滌量。自動(dòng)洗板機(jī)會(huì)分配洗滌液。如果你之前遭遇過(guò)高背景，那么不要猶豫，將洗滌量調(diào)為高，*好是比包被體積更高。太少的洗滌液會(huì)讓一部分分析表面洗滌不到，從而明顯增加背景。所有反應(yīng)孔的洗滌量必須相同。
ELISA試劑盒的使用手冊(cè)中列出包被量。我們建議使用350μl洗滌液進(jìn)行洗滌，以便清潔整個(gè)反應(yīng)孔的壁。一般來(lái)說(shuō)，洗滌量越高，則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。
影響洗滌效果的主要參數(shù)是洗滌循環(huán)的量。當(dāng)然，洗滌次數(shù)越多，背景越低。然而，太多次的洗滌會(huì)降低信號(hào)強(qiáng)度，使其難以測(cè)定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌三次。不過(guò)，一般而言，包被平板需要的洗滌次數(shù)比用戶包被的平板要少。對(duì)于用戶包被的ELISA板，必須優(yōu)化洗滌次數(shù)。
控制洗滌量和洗滌次數(shù)的另一種方法是加入過(guò)量的洗滌液。一般來(lái)說(shuō)，96孔板的每個(gè)孔能容納330至460 μl。不過(guò)，有些自動(dòng)化洗板機(jī)可設(shè)置程序，分配遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出這個(gè)量的洗滌液，比如1 ml。它是如何做到的呢？其實(shí)很簡(jiǎn)單，就是在分液的同時(shí)打開(kāi)吸液功能。換句話說(shuō)，隨著分液器分配更多的液體，抽吸器也將液體吸出。這種技術(shù)能增加洗滌量，但不會(huì)溢出到其他孔中。
還有一些參數(shù)會(huì)影響洗滌步驟的效果。這些參數(shù)包括吸液高度和吸入位置，這兩者都能調(diào)整，以降低背景（殘留量）和差異。
殘留液體中包含未結(jié)合的抗原或抗體，它們會(huì)增加背景信號(hào)。殘留量越小，殘留液體越少，轉(zhuǎn)移到下一步的干擾液體也就越少。
吸液高度會(huì)明顯影響殘留量；如果洗滌吸頭與反應(yīng)孔底部的距離稍大，那就會(huì)讓殘留量急劇增加。反之，如果洗滌吸頭壓著反應(yīng)孔底部，那么也會(huì)使吸液效率降低，殘留量增加。
目前的洗板機(jī)一般使用兩種類(lèi)型的洗頭：剛性和浮動(dòng)。浮動(dòng)洗頭中的吸頭可在洗滌過(guò)程中自由上下移動(dòng)，而剛性洗頭則固定在適當(dāng)?shù)奈恢?。使用剛性洗頭的洗滌操作在優(yōu)化起來(lái)更為復(fù)雜，因?yàn)槟阈枰浅Ｗ屑?xì)地調(diào)整吸液高度。如果你們實(shí)驗(yàn)室使用幾種不同的板，那可能會(huì)很耗時(shí)。在使用浮動(dòng)洗頭時(shí)，吸頭會(huì)降到反應(yīng)孔的底部。調(diào)整高度就不是很重要，因此洗頭會(huì)下降到底部。
抽吸的位置也對(duì)殘留量有著重要影響；如果每個(gè)孔只使用一個(gè)抽吸點(diǎn)（這很常見(jiàn)，因?yàn)楦欤?，那么抽吸的位置需要?yōu)化。*佳的位置取決于洗頭的性狀，但它幾乎不在反應(yīng)孔的中間，即使這是所有洗頭*常見(jiàn)的默認(rèn)位置。一般來(lái)說(shuō)，*佳位置在孔中間與孔壁之間的某處。
反應(yīng)孔的形狀也會(huì)影響殘留量。C形底（平底圓角）的微孔板一般會(huì)比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。
1.需每天校正注液量及殘液量，洗滌后殘液量不得大于2 μl。
2.及時(shí)更換破損吸液針，避免破壞底板包被。
3.針對(duì)不同廠家酶標(biāo)板注意調(diào)整吸液頭下降高度，避免沖洗針頭卡住酶標(biāo)板。
4.注意調(diào)整洗液量，洗液量過(guò)多將溢出，過(guò)少將達(dá)不到洗滌效果。
5.關(guān)機(jī)前使用蒸餾水沖洗管道，避免洗液的結(jié)晶物堵塞管道。
6.不同種試劑盒的洗液嚴(yán)禁混合使用。
為了洗滌效果較好，實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法，在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1～2次，能達(dá)到理想的洗滌效果。ELISA看起來(lái)很簡(jiǎn)單，但是在實(shí)際操作過(guò)程中，絕不能掉以輕心，除了嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作，高品質(zhì)的試劑盒與專(zhuān)業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)也是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的保證！
1.ELISA產(chǎn)品種類(lèi)豐富：已上線3600種，有普通、高敏兩個(gè)系列，覆蓋15個(gè)研究領(lǐng)域；
2.樣本量少：人、大鼠樣本量需50uL，小鼠只需10uL；
3.操作時(shí)間短：*快2h完成孵育；
4.嚴(yán)格質(zhì)控：精密度（板間、板內(nèi)變異系數(shù)）準(zhǔn)確度（回收率、稀釋線性）樣本值等8項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)檢測(cè)；
5.發(fā)表的SCI文章數(shù)不勝數(shù)，*高影響因子可達(dá)15.84。
