如何把細(xì)胞養(yǎng)的更漂亮Ⅲ（污染拯救篇）！看完再也不怕細(xì)胞污染！

對于細(xì)胞培養(yǎng)防止污染的措施等注意事項，相信各位園子里的朋友們呢都知道的差不多，其實實際情況也就是那些步驟了，主要就是在于各位操作的嫻熟程度了。所以這個預(yù)防還是在于大家的鍛煉。我今天主要談細(xì)胞污染之后的拯救。繼續(xù)我的專題！

7.細(xì)胞污染之后的拯救！

對于貼壁生長的細(xì)胞，相對來說比較簡單但很麻煩。以下我主要討論貼壁生長的細(xì)胞。

在討論之前，大家首先要有一個概念，即潔凈區(qū)，并不是沒有**，而是**的數(shù)量非常少，國家標(biāo)準(zhǔn)100級的潔凈標(biāo)準(zhǔn)是浮游菌數(shù)不得超過5個每立方米，沉降菌數(shù)不得超過1個每培養(yǎng)皿.而國外的標(biāo)準(zhǔn)比我國的還要高一點(diǎn)，要求的數(shù)量更少。

所以在我們的潔凈操作臺里，并不是真正一個**都沒有的，所以在操作的時候還是要盡量利索迅速地完成操作。盡量減少進(jìn)入培養(yǎng)體系**的數(shù)量。

所以處理**污染的重要原則就是：無限地稀釋**的濃度，無限地減少**的數(shù)量！

1）.將污染的培養(yǎng)液倒掉，轉(zhuǎn)燒瓶口，加入10mlPBS，適當(dāng)晃動清洗培養(yǎng)瓶，然后倒掉。轉(zhuǎn)燒瓶口。

2）.繼續(xù)加入10mlPBS，同樣方法晃動，清洗培養(yǎng)瓶，然后倒掉。

3）.繼續(xù)加入5mlPBS，同樣方法洗瓶，主要是培養(yǎng)面，然后倒掉。

4）.重復(fù)步驟3再洗。

5）.重復(fù)步驟3再洗。

6）.加入3-5ml雙抗，洗瓶，靜置3-5分鐘，然后吸出。

7）.加入3ml雙抗，洗瓶，靜置3-5分鐘，然后吸出。

8）.再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。

9）.加入10ml培養(yǎng)液，加入2ml雙抗，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5小時之后，倒掉培養(yǎng)基，加入PBS洗瓶兩次，然后加入胰酶消化，吹打后置于離心機(jī)800-1000r/min離心，然后洗一次。置于新的培養(yǎng)瓶里培養(yǎng)，培養(yǎng)體系加入2ml雙抗。

10）.24h之后，視情況換液，若仍然污染嚴(yán)重，培養(yǎng)基渾濁，重復(fù)以上步驟，若看不到污染物，則繼續(xù)步驟1)、3）、4）、6）、8），然后加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)體系加入2ml雙抗.

11).24h之后，若仍污染嚴(yán)重，可再重復(fù)一次，若還污染只能棄之（不過一般沒有出現(xiàn)這種情況），若鏡下不見污染物，則換液PBS洗瓶，正常培養(yǎng)。

以上是對于**污染（常見為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）；若為霉菌或者**污染，加入兩性霉素B清洗和培養(yǎng)，終濃度一般為2.5μg/ml（在30μg/ml時會有細(xì)胞毒性）。另外也可以選擇在培養(yǎng)基里加3ug/ml的制霉菌素或放線菌素D。其它操作同；若為支原體或者黑膠蟲污染，因為這個太難處理，所以我基本上都是重新弄細(xì)胞了。處理的代價更大更麻煩。但是也是有專門針對黑膠蟲和支原體污染的試劑的，但是我沒有試過。比較貴呵呵。

有同學(xué)說用泰樂處理支原體污染效果比較好。大家可以試試，我下次也會試一試。至于黑膠蟲的話，我覺得真的是沒有辦法了，還是需要你在無菌觀念和無菌操作上下大功夫加強(qiáng)了，真的黑膠蟲在科研領(lǐng)域還是很未知的啊。所以沒有什么好的應(yīng)對方法。預(yù)防為主??！還是要強(qiáng)調(diào)無菌操作?。?！尤其注意血清的質(zhì)量！這個是主要來源。一般建議用北美血清，這個黑膠蟲污染會概率小。

以上方法主要是針對貼壁生長的細(xì)胞，在操作的過程中，一定要小心操作動作，輕柔緩慢，切忌大動作魯莽。防止細(xì)胞脫落。以上方法操作得當(dāng)，基本上都能救活你的細(xì)胞（我還沒有聽到?jīng)]救活的反饋）。當(dāng)然如果你的細(xì)胞仍有富余或者凍存的，我還是建議你把污染的扔掉，再復(fù)蘇方便省事。這個拯救細(xì)胞還是主要針對你就只剩這一瓶細(xì)胞無路可退的時候。